Préparation de grands échantillons biologiques pour haute

May 05, 2023

Nature Protocols volume 18, pages 1441–1461 (2023)Citer cet article

1781 accès

1 Citations

2 Altmétrique

Détails des métriques

L'imagerie à différentes échelles est essentielle pour comprendre la morphologie des organes sains et les changements physiopathologiques. La morphologie tridimensionnelle à macro et micro-échelle de grands échantillons, y compris des organes humains intacts, est possible avec la microtomographie aux rayons X (utilisant des sources de laboratoire ou synchrotron). Cependant, la préparation de grands échantillons pour l'imagerie haute résolution est difficile en raison de limitations telles que le rétrécissement de l'échantillon, le contraste insuffisant, le mouvement de l'échantillon et la formation de bulles lors du montage ou de la numérisation. Ici, nous décrivons la préparation, la stabilisation, la déshydratation et le montage de grands échantillons de tissus mous pour la microtomographie aux rayons X. Nous détaillons le protocole appliqué aux organes humains entiers et à la tomographie à contraste de phase hiérarchique à l'installation européenne de rayonnement synchrotron, mais il est applicable à une gamme d'échantillons biologiques, y compris des organismes complets. Le protocole améliore le contraste lors de l'utilisation de l'imagerie par rayons X, tout en empêchant le mouvement de l'échantillon pendant le balayage, même avec des orientations d'échantillon différentes. Les bulles piégées lors du montage et celles formées lors du balayage (dans le cas de l'imagerie par rayons X synchrotron) sont atténuées par de multiples étapes de dégazage. La préparation des échantillons est également compatible avec l'imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et l'observation histologique. La préparation et le montage de l'échantillon nécessitent 24 à 36 jours pour un grand organe tel qu'un cerveau ou un cœur humain entier. Le temps de préparation varie en fonction de la composition, de la taille et de la fragilité du tissu. L'utilisation du protocole permet la numérisation d'organes intacts d'un diamètre de 150 mm avec une taille de voxel local de 1 m. Le protocole nécessite des utilisateurs ayant une expertise dans la manipulation d'organes humains ou animaux, le fonctionnement en laboratoire et l'imagerie par rayons X.

La quantification de la morphologie des organes humains, à la fois en santé et en maladie, est une tâche complexe qui peut être abordée par des modalités d'imagerie spatiale multimodale, capables de s'étendre sur plusieurs échelles dimensionnelles. La caractérisation morphologique complète des tissus nécessite la détection des interactions entre et à travers les échelles ; cependant, la plupart des techniques d'imagerie sont limitées soit par la résolution, soit par le champ de vision, ce qui rend difficile le rapprochement entre les observations et les données macroscopiques et microscopiques. Les approches conventionnelles d'histologie1,2,3 ou de microscopie électronique4,5,6 permettent la visualisation de l'organisation et de la composition microstructurales du tissu à travers des coupes en série, et les données peuvent être convenablement quantifiées ; cependant, ces approches nécessitent normalement un échantillonnage et une section du tissu et sont extrêmement laborieuses et chronophages. La compensation optique combinée à la microscopie à feuille de lumière peut fournir un large champ de vision avec une haute résolution; cependant, la compensation des tissus nécessite également de grandes échelles de temps et est souvent coûteuse ; de plus, la profondeur d'imagerie pour un microscope à feuille de lumière est limitée par la distance de travail de l'objectif7,8. Même lorsque des organes humains adultes entiers8 ou des animaux entiers9 ont été éliminés sur une période de plusieurs mois, leur imagerie reste difficile. Des inconvénients similaires s'appliquent à la tomographie par cohérence optique10,11, à la microscopie multiphotonique12 ou à la microscopie confocale13,14, qui peuvent capturer la microstructure tridimensionnelle (3D) locale du tissu à l'échelle cellulaire, mais ont une pénétration tissulaire limitée, ce qui entrave l'imagerie des tissus profonds15. Récemment, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) à haute résolution a atteint une taille de voxel isotrope de 100 µm dans un cerveau humain entier ex vivo16. Bien que l'IRM soit non destructive et ait un large champ de vision17, la résolution n'est toujours pas suffisante pour examiner la microstructure des tissus. Les techniques d'imagerie hiérarchique sont capables de surmonter le compromis entre la résolution et le champ de vision. Dans une approche hiérarchique, plusieurs images du même échantillon sont acquises à différentes résolutions pour combler les différentes échelles. La tomodensitométrie (µCT) a été utilisée pour imager des poumons entiers avec une résolution de voxels de 150 μm, suivie d'une extraction ultérieure de noyaux de biopsie dans les poumons; ces petits noyaux ont ensuite été scannés avec µCT pour obtenir des voxels de 10 μm18.

Des progrès considérables ont été réalisés dans le domaine de l'imagerie par rayons X au cours de la dernière décennie, en particulier pour la visualisation des tissus mous19. La tomodensitométrie par rayons X synchrotron (sCT) s'est avérée être l'une des techniques d'imagerie basées sur les rayons X les plus puissantes en raison de sa luminosité élevée20, permettant l'observation des tissus mous à haute résolution, avec suffisamment de contraste pour détecter les composants microstructuraux21, tels que les neurones individuels22 ou les fibres d'élastine23. En particulier, le sCT24 basé sur le contraste de phase, combiné à des procédures optimisées de préparation et de montage des échantillons, a fourni des informations détaillées sur l'orientation des fibres cardiaques25,26 et, séparément, sur les cartes cellulaires cérébrales27. L'imagerie à contraste de phase fait référence à la détection des déphasages d'un faisceau de rayons X émis par un échantillon28. Cette technique permet de visualiser des tissus mous qui seraient indétectables avec la tomographie à rayons X conventionnelle en l'absence d'agent de contraste29. Néanmoins, les études utilisant la sCT sont principalement limitées aux organes fœtaux30, à de petits sous-échantillons d'organes humains adultes31 ou à des organes de modèles de petits animaux, par exemple la souris32 et le lapin33, en raison du champ de vision restreint. Certaines études ont démontré l'imagerie d'échantillons plus grands, comme des coelacanthes d'un diamètre atteignant 10 cm et d'une hauteur de 30 cm34,35 ; cependant, la taille du voxel était limitée à 30 µm et la structure d'intérêt était constituée de tissus durs ou de cartilages.

Les sources synchrotron de quatrième génération, telles que la source extrêmement brillante de l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), fournissent suffisamment de cohérence spatiale et de flux de faisceau pour visualiser les organes humains intacts de la macro à la micro-échelle. En utilisant la source extrêmement brillante de l'ESRF, nous avons récemment développé une technique appelée tomographie à contraste de phase hiérarchique36 (HiP-CT) qui permet le balayage de grands organes humains intacts avec des voxels isotropes d'environ 20 µm, avec un zoom ultérieur (sans sectionnement), atteignant jusqu'à 1 μm de voxels isotropes localement. Bien que souvent négligés, la préparation et le montage des échantillons sont cruciaux pour obtenir les résolutions les plus élevées avec cette technique et d'autres, en particulier lors de la visualisation de grands échantillons de tissus mous, tels que les organes humains, où le rapport de la taille du voxel au diamètre de l'organe est de 1:150 000 (1 µm en 150 mm). Le diamètre maximal imageable est limité par l'équipement et les paramètres de configuration de la ligne de lumière, tels que la largeur du faisceau de rayons X, la taille du détecteur, la puissance de calcul disponible pour reconstruire les données et la taille des données. Actuellement, le diamètre d'organe maximal que nous avons imagé est de 150 mm, mais la configuration actuelle serait compatible jusqu'à 250 mm de diamètre sur 500 mm verticalement.

Le succès de toutes ces techniques expérimentales dépend de la préparation minutieuse de l'échantillon pour éviter les artefacts d'imagerie. L'imagerie des tissus mous à l'aide de µCT ou sCT présente un certain nombre de défis par rapport aux tissus durs. L'un de ces problèmes est le manque de contraste lorsqu'il est imagé avec des rayons X en raison des densités similaires des composants de l'échantillon. De plus, les algorithmes de rétroprojection généralement utilisés pour reconstruire le volume 3D à partir de projections de rayons X ne supposent aucun mouvement de l'échantillon pendant le balayage. La plupart des méthodes de préparation des échantillons sont conçues pour empêcher la dérive ou la déformation de l'échantillon, afin d'éviter les artefacts de mouvement qui réduiraient la qualité des images37. Certains algorithmes de reconstruction, tels que la compensation de mouvement38,39 ou l'apprentissage automatique40,41, ont été développés pour surmonter ce problème42, mais ils restent complexes et coûteux en termes de calcul19.

Bien que le protocole que nous décrivons soit applicable à un large éventail d'échantillons biologiques de différentes tailles et utilisant une gamme de modalités d'imagerie, nous nous concentrons ici sur les échantillons à imager à l'aide de l'imagerie par contraste de phase synchrotron. La méthode est également applicable à d'autres modalités d'imagerie ; cependant, la procédure peut nécessiter une optimisation en fonction de la taille de l'échantillon et de la modalité choisie (voir les étapes du protocole pour d'éventuelles recommandations d'optimisation).

Le protocole de préparation et de montage des échantillons décrit ici a été développé à partir de la nécessité d'imager de grands volumes biologiques, tels que le poumon humain intact, le cerveau, le cœur, les reins et la rate. La technique permet le balayage d'organes entiers avec une taille de voxel isotrope de 25 µm. Les zones sont ensuite sélectionnées pour un balayage ultérieur à haute résolution sans nécessiter de biopsies. Pour imager des structures aussi grandes, un faisceau de rayons X à haute énergie est nécessaire pour pénétrer les échantillons. Nous avons utilisé un faisceau polychromatique avec une énergie allant de 64 à 120 keV pour l'imagerie des organes, mais des énergies plus élevées (jusqu'à 140 keV) seraient optimales, si elles étaient disponibles.

La préparation et la stabilisation de l'organe pour cette technique sont essentielles car toute inhomogénéité de densité, bulles de gaz ou mouvement pendant le balayage réduirait considérablement la qualité de l'image. Au cours du développement de la méthode, plusieurs défis se sont posés, comme décrit dans la Fig. 1 des données étendues. Cela a été résolu en limitant la dose absorbée par l'échantillon et en incluant plusieurs étapes de dégazage pendant la préparation de l'organe et la procédure de montage. Le mouvement de l'échantillon pendant la numérisation est un défi supplémentaire, d'autant plus que les échantillons sont volumineux et nécessitent donc souvent beaucoup de temps (> 5 h) pour imager. Ce défi a été résolu en emballant soigneusement un mélange de gel d'agar broyé et de liquide (dans notre cas, l'éthanol à 70 %) comme support de montage autour de l'organe. De plus, la déshydratation de l'organe avec de l'éthanol a augmenté le contraste des images43 et diminué la formation de bulles.

Ici, nous présentons une procédure pour préparer des organes humains entiers pour l'imagerie avec sCT, µCT, CT médical et IRM qui est compatible avec une étape finale de l'histologie intégrée à la paraffine classique. Dans ce protocole, nous décrivons principalement la préparation de l'échantillon et le montage avec de l'éthanol-agar ; le protocole d'imagerie par rayons X utilisant HiP-CT et son application à une application médicale (quantification des dommages causés par la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) au système vasculaire pulmonaire)44,45. En bref, après fixation du corps (Étape 1A(i)), le ou les organes sont extraits (Étape 1A(ii-iii)), fixés par immersion (Étape 2), déshydratés et dégazés sous vide (Étape 4A) ou par cycles thermiques (Étape 4B) en fonction de leur fragilité, montés avec un mélange de gel d'agar broyé (Étapes 5 à 33) et imagés par sCT (Étapes 34 à 54), µCT (Étape 55), CT clinique (Étape 55) et IRM (étape 55), et enfin, une analyse histologique est effectuée (étape 56). Pour un aperçu de la procédure, voir Fig. 1.

Le protocole contient trois étapes principales (acquisition et préparation d'organes, montage d'organes et imagerie) indiquées dans des cases à code couleur. L'organe peut être récupéré soit d'une biobanque, d'une chirurgie, d'une transplantation rejetée ou il peut être extrait d'un corps donné. Nous proposons deux protocoles de dégazage en fonction de la fragilité de l'organe (dégazage sous vide et dégazage par cycles thermiques). Une fois l'échantillon monté avec le gel d'agar, différentes techniques d'imagerie peuvent être réalisées (µCT, sCT, CT clinique et IRM). Après imagerie, une histologie peut être réalisée sur l'échantillon.

Ce protocole a été développé et optimisé pour la préparation d'organes humains entiers à imager à haute résolution avec HiP-CT, comme le montre la Fig. 2, et a été appliqué à divers organes, notamment le cerveau, le cœur, les poumons, les reins et la rate. Néanmoins, la procédure de préparation d'organes est flexible et peut être utilisée avec des tissus mous d'origine animale ou même avec de petits animaux intacts. Une liste d'organes humains et d'échantillons biologiques imagés avec cette méthode et le temps de préparation pour chaque étape sont fournis dans la Fig. L'un des principaux inconvénients de l'enrobage humide tel que l'immersion dans l'alcool est la dérive de l'échantillon, qui crée des artefacts de mouvement37. L'inclusion de paraffine et le séchage au point critique modifient la structure de l'échantillon pour augmenter sa rigidité, permettant à l'échantillon d'être immobile pendant une longue période de temps.

a, Vue 3D du cœur humain imagé à l'aide de la ligne de lumière BM05 à l'ESRF. b–d, Coupes transversales du cœur avec une taille de voxel isotrope de 25 µm (b), 6,5 µm (c) et 2,5 µm (d). e, Grossissement de l'image 2,5 voxels avec annotation sur les principales structures observées (ca, artère coronaire ; mc, cellules myocytaires ; ad, tissu adipeux). Toutes les informations de base sur le patient à l'origine de cet organe sont fournies dans les données étendues Fig. 2. Toutes les expériences ont suivi les réglementations éthiques gouvernementales et institutionnelles pertinentes pour les expériences humaines.

Dans ce protocole, le mouvement de l'échantillon est empêché par l'utilisation de petits blocs de gel d'agar et de gel d'agar broyé en équilibre de densité avec le liquide de montage, maintenant l'échantillon en place. Les scans pris à plusieurs mois d'intervalle sur le même échantillon préparé avec notre protocole de stabilisation d'organes peuvent simplement être enregistrés à l'aide d'une transformation rigide manuelle. Cela démontre la stabilité de cette méthode sur de longues périodes. Un problème commun à toutes ces méthodes de préparation d'échantillons est le rétrécissement des tissus. Cet effet peut gêner la quantification morphologique et conduire à des analyses erronées. Cependant, par rapport à l'enrobage de paraffine46,47 et au séchage du point critique37,48, le rétrécissement de l'échantillon dans ce protocole peut être atténué à l'aide de plusieurs bains d'éthanol dans des concentrations d'éthanol ascendantes43 jusqu'à 70 %, préservant ainsi la morphologie du tissu. De plus, la déshydratation de l'échantillon avec de l'éthanol assure un contraste plus élevé avec µCT43,49 ou sCT50. Ce protocole de préparation des échantillons est compatible avec de nombreuses techniques d'IRM, de TDM clinique et d'histologie (après imagerie 3D et démontage). Enfin, si le matériel d'imagerie spécifique peut être spécialisé, le protocole de préparation peut être mis en œuvre dans n'importe quel laboratoire biologique disposant d'une hotte adéquate. L'équipement et les matériaux sont facilement disponibles auprès de fournisseurs scientifiques standard, l'équipement le plus spécialisé étant une pompe à vide et une chambre de dessiccateur.

Bien que cette procédure présente plusieurs avantages par rapport à d'autres protocoles de préparation d'échantillons, certaines limites doivent être notées.

Le moment des différentes étapes du protocole impliquant la fixation et le dégazage dépend fortement de la composition et de la taille du tissu. Dans la présente procédure, nous donnons des exemples de synchronisation pour différents organes humains ; tandis que le calendrier pour d'autres types de tissus devrait être testé et vérifié. Certaines lignes directrices pour l'optimisation des horaires sont fournies dans ce protocole.

Alors que la fixation de l'organe est essentielle pour la préservation à long terme des tissus, elle modifie les propriétés mécaniques et de diffusion des tissus, ce qui pourrait confondre d'autres mesures. Malgré l'augmentation du contraste de l'image, la déshydratation de l'éthanol affecte également les propriétés mécaniques du tissu43,53. Ceci limite l'utilisation de cette méthode de préparation pour les essais in situ ; cependant, en ne fixant pas le tissu et en remplaçant l'éthanol par de l'eau, il est possible d'utiliser l'imagerie in situ13,54. Ainsi, le protocole pourrait être élargi à l'avenir pour couvrir les expériences dynamiques et la quantification des propriétés mécaniques sur une courte période (car la dégradation biologique se produirait). Si le contraste fourni par l'éthanol n'est pas assez élevé ou n'est pas adapté aux besoins expérimentaux, divers agents de contraste, tels que des agents de contraste à base d'iode55 ou de tungstène56 pourraient être utilisés pour augmenter le contraste global du tissu ou résoudre des composants spécifiques d'intérêt13,56. Si le gel d'agar n'était pas souhaitable pour une application particulière, il pourrait être remplacé par d'autres milieux solides ou élastiques qui seraient en équilibre avec le liquide de montage et relativement amorphes dans sa structure. Par exemple, en cas de montage avec de l'éthanol à 96%, un gel de cristal de bougie transparent peut être utilisé à la place du gel d'agar. En cas de montage à l'eau, des blocs de gélatine ou des blocs de polyacrylamide peuvent également être utilisés.

L'un des principaux inconvénients des méthodes d'inclusion par voie humide est la formation de bulles dues au débit de dose ou à l'accumulation de dose dans le cas du sCT57. Ces bulles peuvent déplacer ou endommager l'échantillon, en plus elles peuvent créer de forts artefacts, réduisant considérablement la qualité de l'image58. Bien que le bouillonnement soit un problème avec d'autres méthodes de préparation standard, par exemple l'inclusion de paraffine, il n'est pas présent avec le séchage au point critique. Dans ce protocole, le problème est atténué par plusieurs étapes de dégazage au cours de la procédure, retardant la nucléation des bulles pendant l'analyse et encore atténué par l'utilisation de rayons X à haute énergie avec un fort contraste de phase. Cependant, seules quelques lignes de lumière sont équipées pour imager les tissus mous à haute énergie avec des propriétés de cohérence et des capacités de propagation suffisantes. La cohérence spatiale doit être suffisamment élevée pour que la distance de propagation puisse être définie pour distinguer la variation de densité de l'échantillon sans flou géométrique. Pour la tomographie à rayons X basse énergie, les étapes de dégazage doivent être effectuées consciencieusement, et le débit de dose contrôlé encore plus soigneusement en raison de la photodissociation de la molécule d'eau.

Les tissus biologiques peuvent être collectés par diverses méthodes. Si l'échantillon est prélevé directement à partir d'une biobanque, d'une chirurgie ou d'une transplantation rejetée (étape 1B), il peut être amené directement à l'étape de fixation de l'échantillon (étape 2). Si les organes proviennent d'un corps donné, une extraction d'organe doit être effectuée (Étape 1A(ii)). L'embaumement du corps est effectué peu de temps après le décès, avant l'extraction d'organes (par un praticien agréé). Le corps est fixé en injectant du formol dilué dans une solution contenant de la lanoline dans l'artère carotide droite (étape 1A(i)). Après éviscération, la fixation complète de l'organe est assurée en l'immergeant dans du formaldéhyde tamponné neutre à 4 % (étape 2). La durée de fixation est définie par la taille de l'organe, par exemple 4 jours pour un cerveau humain. Lors de l'éviscération de l'organe, assurez-vous que le plus possible de tissu environnant est retiré pour réduire le temps de pénétration du fixateur dans l'organe. Le volume de fixateur est également important, nous recommandons un volume au moins quatre fois supérieur au volume tissulaire.

Certains organes, comme les poumons, peuvent nécessiter un gonflage. Cela peut être partiellement accompli au stade de la fixation en utilisant l'instillation de formol dans les poumons sous pression contrôlée59. Le poumon est perfusé avec du formol à 4 % à travers la trachée à l'aide d'une colonne d'eau de 30 cm, la trachée peut ensuite être ligaturée pour maintenir la configuration gonflée sur une période de 2 jours. Le poumon est ensuite immergé dans une solution de formol à 4 % après extraction. Une fois fixé, le remplacement du formol par les bains successifs d'éthanol avec pompage sous vide est couplé à l'injection d'éthanol dans les bronches pour maintenir une forme 3D cohérente. Une pression strictement contrôlée avec dégazage d'éthanol n'est actuellement pas possible avec le protocole proposé, mais devrait devenir possible en utilisant la circulation d'éthanol dégazé instillé à une pression contrôlée. Nos résultats montrent que, même sans inflation strictement contrôlée à l'étape de déshydratation de l'éthanol, les données ont toujours une grande utilité scientifique.

L'organe est déshydraté avec plusieurs bains d'éthanol pré-dégazés. Le passage à l'éthanol à 70 % doit être progressif pour éviter la démarque inconnue43. Une concentration d'éthanol de 70 % a été choisie comme le meilleur compromis entre un retrait contrôlé et un contraste suffisant pour observer les structures d'intérêt en contraste de phase ; cependant, une concentration finale d'éthanol différente peut être utilisée en fonction de l'application. Au cours de cette étape, un dégazage doit être effectué pour éliminer les gaz libres et dissous présents dans le tissu afin d'éviter la formation de bulles ou l'augmentation de volume pendant l'imagerie. Pour les organes humains, nous présentons deux méthodes, selon la fragilité de l'organe pour la déshydratation et le dégazage. Le dégazage sous vide (étape 4A(i–v)) peut être utilisé pour la plupart des organes (cœur, poumon, foie, rein, rate). L'organe est plongé à température ambiante (20 °C) dans quatre bains successifs d'éthanol pré-dégazé de concentrations de 50 %, 60 % et 70 %, puis un deuxième bain à 70 % pour assurer l'équilibre. Une étape de dégazage est effectuée entre les bains. L'équilibre est généralement atteint en 4 j pour chaque concentration pour un organe humain tel qu'un poumon ou un cœur. Le dégazage est réalisé avec une pompe à vide et un dessiccateur par cyclages successifs jusqu'à une pression absolue comprise entre 15 et 10 mbar. Le dégazage est considéré comme approprié lorsqu'aucun fort bullage n'est observé à 10 mbar. Alternativement, le cyclage thermique (entre la température ambiante et 4 ° C) (étape 4B (i)) a été développé pour les organes fragiles, tels que le cerveau humain, car certains dommages ont été observés après l'utilisation de la méthode de dégazage sous vide si les bulles n'étaient pas en mesure de trouver un moyen de sortir du cerveau. Dans cette méthode, quatre cycles thermiques sont réalisés en immergeant l'organe dans quatre bains successifs de 50 %, 60 % et 70 %, et un second à 70 % d'éthanol pré-dégazé. Chaque cycle thermique consiste à plonger l'organe dans le bain d'éthanol fortement dégazé à température ambiante. Le récipient doit être fermé avec soin pour éviter d'emprisonner des bulles d'air. Il est ensuite conservé au réfrigérateur pendant 4 à 5 jours à 4 °C. Pendant cette période, le gaz dissous va diffuser dans l'éthanol environnant, et les bulles vont progressivement se dissoudre. Après ce temps, les solutions et l'organe doivent être ramenés à température ambiante, et un nouveau cycle peut être démarré en utilisant un nouveau bain d'éthanol fortement pré-dégazé. Pour les deux méthodes, le nombre minimum de bains d'éthanol est de quatre pour atteindre une concentration finale de 70 % sans avoir de retrait important. Les temps d'immersion doivent être adaptés et optimisés au type et à la fragilité de l'organe. Le résultat du dégazage peut être testé en réalisant une radiographie de l'organe dans son bocal sans le milieu de montage décrit ci-après. Si quelques bulles restantes sont encore visibles, d'autres cycles thermiques peuvent être effectués avec de l'éthanol à 70 %. Les organes avec des tissus adipeux, comme le cerveau, ont besoin de plus de temps pour s'équilibrer avec l'éthanol. A chaque étape, la déshydratation peut être vérifiée en perturbant le récipient avec l'organe à l'intérieur et en recherchant des stries de densité différente (transparence différente) se formant dans la solution d'éthanol environnante, cela indique la présence d'eau dans l'éthanol.

La déshydratation de l'éthanol est suffisante pour observer les structures d'intérêt avec µCT et sCT lors de l'utilisation du contraste de phase ; cependant, il devrait être possible de combiner ce protocole avec l'utilisation d'un agent de contraste pour résoudre des composants spécifiques de l'échantillon ou lors de l'utilisation de techniques d'imagerie moins sensibles56. L'agent de contraste doit être miscible à l'éthanol à 70 % ou doit être appliqué sur l'organe fixé avant la déshydratation à l'éthanol. Les agents de contraste augmenteraient l'absorption de l'échantillon, ce qui peut améliorer la formation de bulles lors de l'imagerie en cas d'utilisation d'un faisceau de rayons X synchrotron intense.

Dans les cas où la technique de caractérisation n'est pas compatible avec l'éthanol (par exemple, IRM pour la diffusion), le même protocole de dégazage puis de montage peut être appliqué en utilisant de l'eau avec du formol à la concentration souhaitée. Pour les applications in situ nécessitant des conditions proches de la biologie, ce protocole peut également être utilisé avec de l'eau uniquement, mais les échantillons ne peuvent être utilisés que pendant quelques heures car une dégradation biologique se produirait. Des aspects spécifiques de sécurité (travail sous hotte adaptée dans un laboratoire bien aéré, port de gants, d'une blouse de laboratoire, de chaussures fermées et de lunettes de sécurité) sont à respecter car les solutions de formol ou d'éthanol produisent des vapeurs dangereuses.

L'un des principaux problèmes de l'enrobage humide est la présence de bulles. Celles-ci peuvent provenir du protocole de montage (bulles dans les organes ou piégées dans le milieu de montage) et/ou de très fortes doses de rayons X entraînant une évaporation de l'éthanol (en cas de sCT). Dans les deux cas, ils peuvent créer des artefacts importants (Fig. 3), et en cas de bullage à partir de la dose de rayons X, les mouvements des bulles lors du balayage rendent souvent les scans inutilisables60,61. Des tests préliminaires ont montré que le dégazage de l'échantillon avant l'imagerie élimine les bulles piégées et retarde la nucléation et la croissance de nouvelles bulles. Par conséquent, plusieurs étapes de dégazage ont été incorporées dans le protocole pour atténuer la formation de bulles.

a–d, Artefacts dus à la dose de rayonnement (a,b) ou à une bulle stable emprisonnée lors du montage (c,d). a, Une coupe transversale d'un foie humain avec de nombreuses bulles qui se sont développées en raison d'une absorption de dose trop élevée due à un balayage écrasé avec le faisceau allumé pendant plusieurs heures, provoquant des artefacts dans les images. ba, artefact de bulle. b, une coupe transversale du foie imagée après élimination des bulles par dégazage de l'échantillon avec dégazage sous vide. c, une coupe transversale d'un cerveau humain avec une bulle emprisonnée pendant le montage. d, Un zoom sur la bulle piégée à l'intérieur du cerveau. Les images ont été obtenues sur la ligne de lumière BM05 à l'ESRF. Toutes les expériences ont suivi les réglementations éthiques gouvernementales et institutionnelles pertinentes pour les expériences humaines.

Le but de cette étape est de maintenir l'organe en position pendant l'analyse pour éviter les artefacts de mouvement et pour s'assurer que plus d'analyses peuvent être effectuées à un stade ultérieur avec un bon enregistrement rigide 3D entre les analyses/expériences ultérieures. Le gel d'agar ne peut pas être préparé directement avec de l'éthanol à 70 %, mais doit être fait en ajoutant lentement de la poudre d'agar agar dans de l'eau déminéralisée chaude agitée (~85 °C) jusqu'à 20 g/L. Une fois complètement dissoute, la solution d'agar agar est versée dans un récipient approprié et laissée refroidir pendant plusieurs heures. Une fois gélifié, le mélange peut être coupé en petits cubes (Étape 8) et ajouté à 96 % d'éthanol (6 L : 2 L d'éthanol : agar agar) (Étape 9), assurant une concentration finale en éthanol de 70 %. Après dégazage (étape 12) et broyage d'une partie des cubes d'agar (étape 14), le mélange est prêt pour le montage. Si le montage avec du formol est préféré à l'éthanol (par exemple, pour améliorer le contraste avec l'IRM), le bain d'éthanol à 96 % peut être remplacé par un bain de formol à 4 %. Le gel d'agar peut être préparé à l'avance et stocké dans un récipient hermétique pour éviter la réintroduction de gaz dans la solution après son dégazage. La quantité préparée dépend de la taille de l'orgue et du récipient utilisé pour le montage final. Un gel d'agar préparé avec 70% d'éthanol assure une réduction drastique de la formation de bulles lors de l'imagerie. Il est important d'utiliser un gel d'agar broyé et non un gel d'agar mélangé, car le gel mélangé ne tient pas l'échantillon aussi fermement que le gel d'agar broyé et peut entraîner des mouvements pendant l'imagerie. Initialement, seuls des cubes de gélose étaient utilisés pour maintenir l'échantillon en position ; cependant, les cubes se sont avérés trop rigides, créant des déformations là où ils sont entrés en contact avec la surface d'organes mous tels que les poumons. Ainsi, les cubes ne doivent être utilisés qu'en bas et en haut du récipient. Quelques centimètres sont utilisés pour créer une base solide et éviter la rotation de l'échantillon (étape 16). L'agar broyé est utilisé dans le reste du récipient pour maintenir l'échantillon en place. Le mélange d'agar broyé dans le liquide de montage (70 % d'éthanol ou 4 % de formol) doit être ajouté au récipient doucement avec une louche pour éviter le piégeage de bulles de gaz pendant le processus (Fig. 4c). Un dégazage sous vide rapide doit être effectué au moins trois fois lors de l'ajout du gel d'agar broyé pour éliminer les bulles piégées. Ces cycles de vide doivent être réalisés idéalement jusqu'à 15 mbars. Les dimensions du conteneur doivent être aussi proches que possible de l'échantillon afin de minimiser la quantité de matière que le faisceau de rayons X doit traverser ; cependant, l'organe ne doit pas toucher le côté du récipient pour éviter les artefacts dans les images qui compromettraient la précision de la reconstruction (c'est-à-dire qu'un minimum de 5 mm de gel d'agar écrasé doit entourer l'organe pour éviter tout contact direct avec le récipient). Pour le sCT, le récipient utilisé pour le montage doit être en un matériau résistant aux rayons X et pas trop dense, tel que le polyéthylène téréphtalate. Le verre doit être évité car sa densité élevée par rapport aux échantillons entraînerait de forts artefacts de contraste d'absorption. Une fois que le gel d'agar a été compacté autour de l'échantillon (étape 22) et correctement dégazé, le récipient peut être scellé avec un couvercle étanche (étape 28). Le montage doit être évalué pour s'assurer qu'aucun mouvement de l'échantillon dans le récipient n'est possible et qu'aucune bulle n'est visible à l'intérieur. Si certaines bulles sont piégées, un dégazage rapide sous vide peut être utilisé pour les éliminer. La même approche peut être utilisée pour éliminer les bulles dans un organe en cas d'événement bouillonnant dû à une dose élevée lors de la numérisation sCT (ne pas dégazer le récipient scellé, retirer le couvercle, mettre un tamis rigide plat sur le gel d'agar pour empêcher le mouvement de l'organe, puis dégazer, compléter le niveau d'éthanol s'il diminue et éventuellement ajouter une petite quantité de gel d'agar broyé, puis refermer). Un exemple d'agar insuffisamment compacté est présenté dans la vidéo supplémentaire en ligne 1. Avec l'organe fixé et placé dans de l'éthanol à 70 %, l'échantillon peut être conservé pendant des années (Fig. 4d).

a, Dégazage de l'organe dans son récipient à l'aide d'un dessiccateur et d'une pompe à vide. b,c, Après compactage du gel d'agar présent dans le récipient, une partie de l'éthanol est éliminée à l'aide d'une seringue et d'un tamis (b), puis du gel d'agar est ajouté (c). Ce processus se poursuit jusqu'à ce que le gel d'agar soit suffisamment comprimé autour de l'échantillon pour le maintenir en position. d, Échantillon monté stabilisé et dégazé dans le gel d'agar, prêt à être scanné. e, Schéma d'un cerveau monté, comme en d, fixé avec le gel d'agar broyé et les cubes d'agar, dans un récipient scellé. Toutes les expériences ont suivi les réglementations éthiques gouvernementales et institutionnelles pertinentes pour les expériences humaines. Panel e image du cerveau de Smart Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) sous licence CC BY 3.0.

L'imagerie par rayons X et la reconstruction 3D ne sont pas décrites en détail dans ce protocole ; cependant, une description détaillée est disponible dans la littérature36 ou en contactant les auteurs correspondants. Cette méthode a été développée pour l'imagerie des grands organes avec HiP-CT, mais de nombreux aspects seraient bénéfiques pour l'imagerie sCT et μCT (source de laboratoire) plus classique sur des échantillons plus petits, y compris l'immobilisation et l'amélioration du contraste liées à la préparation de l'éthanol. Une fois l'échantillon monté, la numérisation peut être effectuée à tout moment, avec des résultats d'imagerie sCT typiques d'un cœur humain intact illustrés à la Fig. 2. La principale limitation de cette technique est la nucléation et la croissance de bulles suite à l'application de rayons X à haute dose à l'organe dans le cas de sCT. Si seulement quelques bulles apparaissent lors de l'imagerie, l'échantillon peut être laissé au réfrigérateur à 4 ° C pour les dissoudre à nouveau. Si cela ne réussit pas, l'échantillon peut être re-dégazé par pompage sous vide sans avoir à démonter, mais il y aura inévitablement quelques petits mouvements de l'échantillon pendant le processus, ce qui complique la procédure de numérisation et d'enregistrement multirésolution. Plusieurs solutions existent pour éviter la formation de bulles lors de la sCT, pour l'optimisation de la détection, l'augmentation du contraste relatif pour travailler avec une dose plus faible, un meilleur contrôle de la dose, un meilleur traitement des données ou avoir une période de repos pour les échantillons entre des balayages successifs d'une même zone. Le bullage semble fortement lié à l'effet thermique de la dose sur la vitesse d'évaporation de l'éthanol. Développer des chambres environnementales d'échantillons pour travailler à une température plus basse et assurer un meilleur équilibre thermique peut être un moyen efficace d'atténuer le risque de formation de bulles lié à l'utilisation d'éthanol à 70 %, en particulier pour plusieurs balayages de résolution submicronique sur le même organe.

La méthode de préparation des échantillons présentée dans ce protocole est compatible avec l'IRM (Fig. 5c), ce qui la rend très propice aux études multimodales. Cependant, un certain nombre de considérations doivent être prises en compte avant de décider de la méthode de préparation des échantillons et de l'ordre de numérisation. La déshydratation de l'échantillon avec de l'éthanol augmente le contraste pour l'imagerie par rayons X, mais peut affecter les images RM62. La majorité des techniques RM dépendent fortement de la teneur en eau. Ainsi, en déshydratant l'échantillon, le contraste entre les tissus qui retiennent bien l'eau (par exemple, le tissu adipeux) et ceux qui se déshydratent efficacement (par exemple, le tissu musculaire) est renforcé. Cependant, en diminuant la teneur totale en eau, le signal est réduit et certaines techniques telles que la RM pondérée en diffusion ne sont plus possibles. Une méthode pour surmonter ce problème consiste à ne pas déshydrater l'échantillon mais à préparer l'échantillon directement dans un montage au formol pour effectuer d'abord une IRM. Le contraste des images sCT est alors réduit, mais le rapport signal sur bruit des images IRM est augmenté. Bien que le tissu fixé au formol ou au paraformaldéhyde soit la méthode de préparation d'échantillon la plus utilisée pour l'IRM ex vivo, cette technique affecte également la qualité des images63. La fixation des tissus avec du formol ou du paraformaldéhyde réduit T1, T2 et la diffusivité des tissus, réduisant ainsi le contraste au bruit dans les images. Une approche consiste à laver le cerveau pour éliminer le fixateur avant l'imagerie IRM, ce qui peut restaurer les valeurs T2 de pré-fixation mais pas le T1 (réf. 64). Le lavage compromettra également les étapes de dégazage précédentes, de sorte que l'importance relative de chaque modalité d'imagerie doit être soigneusement pesée par rapport au pipeline d'imagerie global et aux exigences d'enregistrement multimodales.

a, vue 3D du rein humain. b, Coupe transversale du rein imagée par CT médical, avec une taille de voxel de 625 µm. c, Coupe transversale du rein imagée avec une IRM médicale 3T, avec une taille de voxel de 220 × 200 × 200 µm3. d, Coupe transversale du rein imagé avec sCT, avec une taille de voxel de 25 µm sur la ligne de lumière BM5 ESRF. e, Comparaison de sCT et d'une coupe histopathologique colorée à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). L'histologie a été réalisée après toutes les autres modalités d'imagerie. Les techniques histologiques utilisées sont standard et bien documentées dans la réf. 72. La colonne de gauche montre des images de micrographie optique de coupes histopathologiques colorées par H&E, la colonne de droite montre des images sCT 2D prises sur la ligne de lumière BM05 à l'ESRF avec une taille de voxel de 1,4 μm. Les images avec une étoile en haut à gauche ont été pseudocolorées (à partir de sCT) ou converties en niveaux de gris avant d'être inversées en contraste (à partir de l'histologie). Toutes les informations de base sur le patient à l'origine de cet organe sont fournies dans les données étendues Fig. 2. Toutes les expériences ont suivi les réglementations éthiques gouvernementales et institutionnelles pertinentes pour les expériences humaines. Panneau e adapté avec la permission de la réf. 36, Springer Nature America, Inc.

Le protocole décrit ici nécessite une expérience préalable dans la manipulation des organes humains ou animaux. Si des organes humains sont utilisés, un pathologiste devrait faire partie de l'étude pour gérer l'embaumement du corps et la dissection des organes. Le dégazage de l'organe, la préparation de la solution de gélose et le montage de l'organe nécessitent l'expertise d'un technicien de laboratoire, car ces étapes impliquent la manipulation de matières dangereuses telles que le formol et la solution d'éthanol. Ce protocole a été développé et optimisé pour l'imagerie de grands organes, un scientifique qui a une expérience en CT ou sCT est nécessaire car l'imagerie de telles grandes structures n'est pas triviale.

Toutes les expériences présentées ici ont été autorisées par l'ESRF, le Laboratoire d'Anatomie des Alpes Françaises et l'Institut de Pathologie de Hanovre à Medizinische Hochschule, Hanovre (vote éthique n° 9022_BO_K_2020). Les protocoles de transport et d'imagerie ont été validés par la Direction de la Recherche en Santé et le Système Intégré d'Application de la Recherche (200429) et le Ministère de la Santé. Toutes les dissections d'organes respectaient la mémoire du défunt. L'étude post-mortem a été réalisée selon les recommandations de l'échelle Quality Appraisal for Cadaveric Studies65.

Les réglementations éthiques institutionnelles et gouvernementales concernant l'utilisation de tissus humains dans la recherche doivent être recherchées et suivies avant d'entreprendre toute procédure décrite dans ce protocole. Les exigences spécifiques seront fixées par les autorités compétentes. En règle générale, après avoir identifié un échantillon approprié, soit à partir d'un don de corps ou d'une biobanque, un comité d'éthique devrait examiner le projet. Une fois le projet accepté, des contrats et/ou accords de transfert de matériel (MTA) doivent être établis pour transférer les échantillons biologiques entre les institutions. Les délais d'obtention de l'accord éthique et du MTA peuvent être considérables (plusieurs semaines à plusieurs années), selon les pays concernés et les spécificités du contrat.

Organes humains obtenus à partir d'un corps donné

Les réglementations éthiques institutionnelles et gouvernementales concernant l'utilisation d'humains pour la recherche scientifique doivent être respectées.

Formol neutre tamponné à 4 % (50 % Hygeco, n° cat. 07040 + 50 % Hygeco, n° cat. 07020 ; dilué à 4 %)

Toxique, cancérigène, mutagène, reprotoxique et inflammable. Manipuler avec précaution, sous une hotte aspirante. Éviter l'inhalation et l'exposition de la peau ou des yeux.

Ethanol 96% (Cheminol France, réf. 20× 4-2)

Agar Agar (Nature et Aliments, cat. n° 510190)

Les propriétés gélifiantes de l'agar diffèrent selon le producteur. Nous vous recommandons d'utiliser le fournisseur indiqué pour reproduire les résultats présentés ici. Si vous en utilisez d'autres, des tests préliminaires seraient nécessaires.

Eau déminéralisée (Sigma Aldrich, cat. n° 38796)

Hotte (laboratoire Iberis, réf. SPR18)

Gants Nitril (Showa, cat. no. 7500PF)

Essuie-tout (Paredes, n° cat. 404857)

Instruments de dissection (Fisher Scientific, n° cat. 11738551)

Pompe à vide (Marshall Scientific, réf. VME8)

Dessiccateur sous vide (SP Bel-Art, réf. F42400-4031)

Réfrigérateur (Fisher Scientific, n° de cat. 22651264)

Grand récipient étanche en polyéthylène téréphtalate (Medline Scientific, n° de cat. 129-0592, ou Lock & Lock, n° de cat. INL-403 ou Lock & Lock, n° de cat. INL-203, illustré dans Données étendues Fig. 4)

Système vortex magnétique équipé d'une plaque chauffante (Fisherbrand, réf. 15349654)

Râpe électrique (Seb, réf. DO201141)

Louche (Tefal, réf. K1180214)

Couteau long (Ikea, cat. n° 402.947.22)

Seringue 50 ml (PentaFerte, réf. 002022960)

Tamis (Profilstore, réf. toilinox_PGRI1ME213)

Ruban vinyle à usage général (3 M, cat. n° 764)

Perceuse (DeWALT, n° cat. DCD791P2-QW)

Porte-conteneur (sur mesure, décrit dans les données étendues Fig. 5 et dans la réf. 36)

Installation de microtomographie synchrotron. Nous avons utilisé les lignes de lumière BM05 et BM18 de l'ESRF. Les paramètres de la ligne de lumière de tous les scans d'organes présentés dans cet article sont détaillés dans les données étendues Fig. 6.

Reconstruction des données : serveur rack Dell EMC PowerEdge R7525 (système d'exploitation : Ubuntu 20.04.3 LTS ; unité centrale : AMD EPYC 75F3 2,95 GHz, 64 cœurs ; mémoire : DDR4-3200 32 Go (32×) ; unité de traitement graphique : NVIDIA Ampere A40 ×2 ; disque dur : 2,4 To 10 K RPM SAS 12 Gbit/s)

Visualisation des données : Dell Precision 7920 Tower (système d'exploitation : Windows Server 2016 ; unité centrale : processeur Intel Xeon Platinum 8160 M, 2,10 GHz, 24 cœurs ; mémoire : 1,5 To ; unité de traitement graphique : NVIDIA Quadro P6000 ; disque dur : AVAGO MR9460-16i SCSI 4,67 To)

Code de reconstruction écrit en interne avec MATLAB 2017 disponible sur GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon)

PyHST2 (code de reconstruction tomographique 3D, http://ftp.esrf.fr/scisoft/PYHST2, open source) développé par l'ESRF

ImageJ/Fiji (pré- et post-traitement des données, https://imagej.nih.gov/ij/, http://fiji.sc/, open source)

VGSTUDIO MAX version 3.5 (segmentation et visualisation des volumes, https://www.volumegraphics.com/en/products/vgsm.html)

Toute expérience impliquant l'utilisation d'organes humains doit être approuvée sur le plan éthique par les comités institutionnels ou gouvernementaux compétents.

Prélever l'organe d'intérêt soit en l'extrayant d'un corps donné (option A) soit par le biais d'une biobanque, d'une chirurgie ou d'une transplantation rejetée (option B).

Embaumement du corps et extraction d'organes

Durée ~3 jours

(Facultatif) Embaumer le corps après le décès en injectant séquentiellement 4 500 ml de formol dilué à 1,15 % dans une solution contenant de la lanoline et 4 500 ml de formol dilué à 1,44 % dans l'artère carotide droite (réalisé par un médecin agréé), idéalement avec un drainage jugulaire.

Le formol est volatil et hautement toxique. C'est un irritant oculaire, respiratoire et cutané et un cancérogène probable. Travailler à l'intérieur d'une hotte chimique dans un endroit bien ventilé et porter un équipement de protection individuelle approprié (gants, protection oculaire et blouse de laboratoire).

Le corps peut être stocké jusqu'à 2 ans s'il est correctement fixé et réfrigéré.

Extraire les organes d'intérêt du corps.

Retirez la graisse environnante et le tissu conjonctif.

Prélèvement d'organes auprès d'une biobanque

Le délai dépend des délais administratifs et de livraison

Récupérer l'organe d'une biobanque, d'un cabinet ou d'une greffe rejetée. Le délai entre le prélèvement de l'organe et la fixation au formol doit être minimal. En attendant, l'organe doit être conservé à 4 ° C pour éviter la dégradation du tissu. Les données des donneurs doivent être rendues anonymes conformément aux réglementations gouvernementales. L'organe doit être transporté dans un conteneur scellé.

Durée 4 j

(Facultatif) Fixez complètement l'organe en l'immergeant dans du formol tamponné neutre à 4 % à température ambiante. Nous avons utilisé 4 j de fixation au formol pour respecter les règles de sécurité liées aux autopsies en cas d'agent pathogène (type COVID-19). Nous recommandons que le volume de formol soit au moins quatre fois supérieur au volume de l'organe. Le volume est estimé par le pathologiste, pour qui il s'agit d'une pratique courante.

Le dégazage avec une pompe à vide doit être effectué sous une hotte ou dans une pièce équipée d'un système de ventilation d'une capacité suffisante pour éviter l'inhalation de formol ou d'éthanol gazeux.

La température ambiante a été fixée typiquement à 20 °C.

(Facultatif) Laver l'échantillon avec de l'eau du robinet pendant 2 min pour enlever le fixateur.

Préparer l'organe pour le montage par déshydratation en utilisant plusieurs bains d'éthanol et en le dégazant sous vide (option A). Avec le protocole de dégazage sous vide, des dommages ont pu être observés dans certains organes fragiles (généralement le cerveau). Ainsi, un protocole alternatif pour préparer l'échantillon sans dégazage sous vide a été développé en utilisant des cycles thermiques (option B). L'éthanol peut être remplacé par une solution de formol à 4 % pour éviter la déshydratation de l'échantillon lorsque cela est indésirable, par exemple en IRM ou en cas d'imagerie par rayons X avec un contraste proche des conditions biologiques. Des modifications de cette procédure peuvent être nécessaires car le moment et le nombre de cycles dépendent fortement de la composition et de la taille de l'organe. Pour des échantillons d'origine, de type et de taille différents, une certaine optimisation de cette étape doit être envisagée.

Déshydratation et dégazage sous vide

Délai 16 j

Plonger l'organe dans un bain d'éthanol à 50% pré-dégazé. La solution doit représenter au moins quatre fois le volume de l'organe.

Placez le récipient avec l'organe à l'intérieur d'un dessiccateur

Éliminer le gaz libre et dissous dans le tissu en diminuant la pression par cycles successifs à l'aide d'une pompe à vide à membrane jusqu'à ce qu'un fort bouillonnement se produise.

Les premiers cycles durent généralement 2 à 3 minutes et atteignent 15 à 30 minutes après trois à quatre cycles pour un organe humain, tel qu'un cœur ou un rein.

ces temps dépendent fortement de la configuration de vide de l'utilisateur.

Continuer ces cycles jusqu'à atteindre 15 à 10 mbar sans forte formation de bulles.

Le dégazage doit être effectué par cycles de durée accrue. A chaque cycle, le pompage du vide est arrêté lorsque le bullage devient brutalement plus intense. Chaque fois qu'un nouveau cycle démarre, le temps avant la première formation de bulles devrait augmenter. Le temps de dégazage doit être adapté à chaque organe en fonction de sa composition et de sa taille. Il n'y a pas de temps type, il faut le choisir empiriquement en regardant le régime de bouillonnement. Cela dépendra fortement de la qualité de la pompe à vide et du dessiccateur.

Dépannage

Attendez jusqu'à l'équilibre (nos tests montrent que généralement 4 jours pour un organe humain tel que les poumons, le cœur ou le cerveau sont suffisants pour chaque concentration d'éthanol ; avec 2 jours seulement, nous avons vu un équilibre incomplet visible sous forme de gradients de densité dans les scans).

Répétez les étapes (i-vi) avec trois bains successifs d'éthanol pré-dégazé à 60 %, 70 % et enfin 70 % avec un dégazage entre chaque bain.

Effectuez un dégazage final de l'orgue pendant quelques minutes juste avant de le monter avec le gel d'agar-agar broyé dans le bocal de montage.

Déshydratation et dégazage des cycles thermiques (protocole alternatif pour les organes fragiles)

Délai 27 j

Au moins quatre cycles thermiques doivent être effectués chacun dans des concentrations successivement plus élevées de 50 %, 60 %, 70 % et 70 % d'éthanol.

Pour chaque concentration successive, utilisez la pompe à vide pour dégazer un volume d'éthanol d'au moins quatre fois le volume de l'organe, à température ambiante.

Ajouter l'éthanol au récipient avec l'échantillon et fermer le récipient avec soin pour éviter de piéger des bulles.

Conserver à 4 ° C pendant 5 jours. Le gaz dissous se diffusera dans l'éthanol environnant, et les bulles se dissoudront progressivement. Les temps d'immersion doivent être adaptés et optimisés au type et à la fragilité de l'organe.

Pour chaque cycle, sortez le récipient du réfrigérateur pour le ramener à température ambiante (~12 h). Un thermomètre peut être utilisé pour mesurer la température de la solution.

Le résultat du dégazage peut être testé en réalisant une radiographie de l'organe dans son bocal sans le milieu de montage décrit ci-après. Si quelques bulles restantes sont encore visibles, d'autres cycles thermiques peuvent être effectués avec de l'éthanol à 70 %. Les organes avec des tissus adipeux, comme le cerveau, ont besoin de plus de temps pour s'équilibrer avec l'éthanol.

Une fois à 70% d'éthanol, l'organe peut être stocké à température ambiante pendant des mois à des années avant de poursuivre les étapes de montage du protocole.

Dépannage

Durée 12 h à 2 j

Ce qui suit produit 5 L de gel d'agar :

Faire bouillir 5 L d'eau déminéralisée dans un récipient à l'aide d'une plaque chauffante équipée d'un système de vortex magnétique.

L'eau bouillante ou la vapeur peut provoquer de graves brûlures. Ne transportez jamais le bidon plein à la main. Au lieu de cela, roulez-le sur un chariot ou un chariot. Utilisez des équipements de sécurité (gants, blouse de laboratoire, chaussures fermées et lunettes de sécurité) et travaillez dans une pièce bien aérée.

Une fois au-dessus de 80°, verser lentement 100 g de poudre d'agar agar (20 g/L) dans l'eau et maintenir le vortex jusqu'à bonne dissolution.

Une fois dissous, arrêter l'agitation et retirer l'agitateur avec une louche.

Verser le liquide dans un grand récipient. Typiquement, on utilise un contenant de 40 × 30 × 12 cm.

L'eau bouillante ou la vapeur peut provoquer de graves brûlures. Utilisez des équipements de sécurité (gants, blouse de laboratoire, chaussures fermées et lunettes de sécurité) et travaillez dans une pièce bien aérée.

Une fois la gélification obtenue (~12 h selon la température), couper le gel d'agar avec un long couteau en cubes de ~2 cm3.

Utilisez les couteaux avec précaution et concentrez-vous toujours sur ce que vous faites.

Plonger les cubes dans 11,7 L d'éthanol à 96 % dans un récipient de 20 L. Le rapport volumique est choisi pour assurer une concentration finale en éthanol de 70 %. Si l'organe a été préparé avec une solution de formol à 4 % au lieu d'éthanol pour éviter la déshydratation de l'échantillon, remplacer l'éthanol à 96 % par du formol à 4 %.

L'éthanol est inflammable, tenez-le à l'écart des sources de chaleur et ayez toujours un extincteur à portée de main. La manipulation d'éthanol ou de formol doit toujours être effectuée sous une hotte aspirante. Éviter l'inhalation et l'exposition de la peau ou des yeux. Utiliser un équipement de sécurité (gants, blouse de laboratoire, chaussures fermées et lunettes de sécurité). Attendre que la densité des blocs soit proche de celle de l'éthanol (~24 h).

Vérifier l'équilibre de la solution en agitant la solution pour mettre les cubes de gel en suspension et s'assurer qu'ils descendent lentement au fond du récipient (en plusieurs dizaines de secondes).

Placer le récipient avec les cubes d'agar et l'éthanol dans le dessiccateur. Pour fermer le dessiccateur, placez le couvercle et fermez lentement en appliquant une légère force. Tournez soigneusement le couvercle dans les deux sens pour assurer une fermeture hermétique. Assurez-vous que le dessiccateur est connecté à la pompe à vide.

Dégazer la solution à l'aide de la pompe à vide pendant deux cycles d'environ 1 h pour éviter de fissurer les cubes d'agar. Les cubes doivent être maintenus immergés pendant le processus pour éviter la déshydratation. Éviter d'exposer les cubes à l'air pendant plus de 10 min. Conserver un tiers des cubes dégazés avec de l'éthanol 70%, dans un récipient hermétique.

Broyer les cubes restants à l'aide d'une râpe électrique.

L'utilisation d'équipements électriques contenant 70% d'éthanol présente un risque d'incendie, l'appareil électrique en question doit être équipé d'un moteur avec protection contre les étincelles et respecter les réglementations incendie appropriées.

Conserver dans un récipient hermétique pour une utilisation future avec suffisamment de solution d'éthanol à 70 % pour s'assurer qu'il n'y a pas d'agar hors de la solution,

Dégazez à nouveau la solution juste avant utilisation.

Durée ~3 h

Remplir le fond du récipient cylindrique étanche avec des cubes d'agarose de quelques centimètres de longueur/largeur. Le conteneur est illustré dans Extended Data Fig. 4.

Remplir la moitié du récipient avec du gel broyé.

Utilisez une louche avec des mouvements lents et prudents lors de la manipulation de la solution d'agar pour éviter d'augmenter le gaz dissous dans la solution ou le piégeage de bulles.

Immergez soigneusement l'organe dans le gel et placez-le dans la position souhaitée pour l'imagerie. Couvrir l'organe avec de l'agar broyé.

Dégazez tout le récipient pour éliminer les bulles piégées.

Cette étape de dégazage vise uniquement à éliminer les bulles piégées. Comme tous les composants ont été dégazés auparavant, cela devrait limiter la quantité de gaz dissous. Ce dégazage sous vide ne doit être effectué qu'avec des temps de pompage courts (2 à 3 min) pendant plusieurs cycles pour aider à éliminer les bulles visibles.

Un léger tapotement sur le dessiccateur peut aider les bulles à se déplacer vers le haut

Ajouter plus de la solution d'agar-éthanol.

Utilisez un tamis pour appuyer sur le gel d'agar par le haut pour le compacter autour de l'organe. Utiliser une seringue pour éliminer l'excès d'éthanol au-dessus du tamis, puis ajouter un volume d'agar et d'éthanol équivalent au quart du récipient.

Attention car une fois la gélose compacte, les bulles ne peuvent plus remonter facilement vers le haut, et donc le dégazage ne peut plus se faire sur cette partie du récipient. Tous les mouvements doivent être effectués lentement et avec précaution pour s'assurer de ne pas piéger de bulles lors du compactage de la gélose.

Appliquer manuellement une pression verticale autour de l'échantillon pour compacter la gélose autour de l'échantillon et maintenir l'échantillon en position jusqu'à ce qu'il ne puisse plus bouger dans le bocal.

Au moins 5 mm de gel d'agar broyé doivent être laissés entre l'échantillon et la paroi du récipient pour éviter les effets de bordure lors de l'imagerie par rayons X.

Dégazer l'ensemble du récipient à l'aide d'une pompe à vide pour éliminer le gaz ajouté au cours des trois dernières étapes et éviter de piéger des bulles dans le gel d'agar. Utilisez des cycles pour faciliter l'évacuation des bulles. Après quelques cycles, si aucune bulle n'est visible lors de l'inspection, passez à l'étape suivante.

Répétez les quatre dernières étapes jusqu'à ce que la gélose soit suffisamment compacte en dessous, autour et au-dessus de l'échantillon pour éviter tout mouvement de l'échantillon. Un exemple d'agar insuffisamment compacté est présenté dans la vidéo supplémentaire 1 en ligne.

Dépannage

Remplissez le récipient étanche jusqu'en haut avec la solution d'agar-éthanol et terminez le remplissage avec quelques cubes d'agar avec la solution pour assurer un bon blocage de l'échantillon.

Percez un petit trou de quelques millimètres de diamètre au centre du couvercle.

Visser le couvercle sur le récipient.

Si le récipient n'est pas directement étanche, utilisez un matériau d'étanchéité tel que du latex parafilm ou du caoutchouc de silicone sur le filetage du récipient pour assurer une bonne étanchéité.

Après le scellage, vérifiez que tout l'air a été éliminé du récipient en appliquant une légère pression sur le couvercle et en vous assurant que l'éthanol sort du trou.

La gélose peut bloquer le trou et empêcher l'éthanol de sortir, auquel cas utiliser une aiguille pour dégager le trou

Appliquez un morceau de ruban adhésif sur le trou du couvercle pour éviter les échanges de gaz entre l'intérieur et l'extérieur du récipient et pour agir comme un échappement de sécurité en cas de formation de bulles lors de la numérisation.

Appliquez du ruban adhésif autour du couvercle pour le protéger et éviter qu'il ne s'ouvre accidentellement.

Vérifiez qu'il ne reste aucune bulle dans le récipient. Une fois que la gélose est compacte, les bulles ne peuvent pas se déplacer facilement vers le haut.

L'organe monté peut être stocké à température ambiante pendant des mois à des années avant l'imagerie, et peut être imagé plusieurs fois sans aucune intervention tant qu'il n'y a pas d'événement bouillonnant dû à une dose de rayons X trop élevée.

Dépannage

Temporisation variable en fonction de la configuration d'imagerie

Les paramètres de la ligne de lumière de tous les scans d'organes présentés dans cet article sont détaillés dans les données étendues de la Fig. 6. Pour plus d'exemples de paramètres de configuration, voir Walsh et al.36. Les étapes 37 à 43 doivent être effectuées par un scientifique parfaitement formé à la ligne de lumière synchrotron.

En cas d'organes réfrigérés et montés, sortez l'organe du réfrigérateur au moins 12 h avant l'expérience et laissez-le à température ambiante pour éviter tout changement de forme pendant l'imagerie en raison du changement de température.

Placer l'orgue dans son récipient scellé sur le porte-récipient. Le porte-conteneur sur mesure que nous utilisons est décrit dans les données étendues Fig. 5.

Placez un deuxième récipient équivalent (appelé récipient de référence) au-dessus du récipient d'échantillon, rempli uniquement du milieu de montage approprié, tel que le gel éthanol-agar.

Configurez le détecteur avec une taille de pixel qui permet à l'ensemble de l'organe d'être imagé. Typiquement pour un cerveau de 14 cm avec une caméra de 5 056 pixels horizontalement, une taille de pixel maximale de 27,7 µm peut être atteinte en acquisition normale.

Alignez le détecteur avec le faisceau de rayons X.

Ajustez les fentes de la ligne de lumière en réglant leur ouverture autour du champ de vision.

Des fentes bien ajustées réduisent la dose déposée sur l'échantillon.

Alignez l'échantillon avec le détecteur et trouvez le centre de rotation.

Réglez l'énergie et le flux pour assurer une pénétration suffisante à travers l'échantillon. L'énergie moyenne optimale dépend de la taille du bocal contenant l'organe. Typiquement, 80 keV pour 10 cm, jusqu'à 110 keV pour 15 cm, surtout si des parties denses comme du cartilage ou des calcifications sont visibles sur les radiographies. Le flux peut être réglé pour ajuster la vitesse de balayage aux exigences de l'expérience tout en étant dans la plage d'énergie correcte et en gardant un débit de dose suffisamment faible pour éviter les bulles.

Il faut faire attention à la dose déposée sur l'échantillon pour éviter la formation de bulles lors du scan. Cette étape doit être effectuée par un scientifique formé à la ligne de lumière. De plus, cette étape est fortement dépendante du type et de la taille de l'échantillon, ainsi que des caractéristiques de la ligne de lumière et de la qualité du dégazage de l'échantillon.

Réglez le temps d'exposition et l'accumulation de la caméra. Typiquement, pour un signal de caméra codé en 16 bits, une valeur de pixel maximale de 42 000 par sous-trame unique permet une forte marge de sécurité pour éviter la saturation, tout en utilisant toute la dynamique de la caméra.

L'augmentation du temps d'exposition augmente le temps de balayage et donc la dose déposée sur l'échantillon.

Assurez-vous que la dynamique de la caméra est optimisée et qu'aucune saturation du détecteur ne se produit pendant le balayage.

Effectuez une analyse du conteneur de référence.

Scannez l'organe complet.

La configuration de la ligne de lumière pour le balayage de référence et le balayage d'échantillon doit être identique.

Dépannage

Créez un champ plat en faisant une moyenne de toutes les projections du balayage de référence effectué à l'étape 44.

Effectuez une reconstruction en une seule tranche en appliquant le champ plat calculé à l'étape 46 et en utilisant un algorithme de rétroprojection filtré66 couplé à une récupération de phase à distance unique pour assurer la qualité des scans (la reconstruction peut être effectuée à l'aide d'un code de reconstruction tomographique open source, tel que PyHST2 (réf. 67) ou TomoPy68).

(Facultatif) Sélectionnez les caractéristiques d'intérêt sur les images reconstruites.

(Facultatif) Calculer les positions du moteur et aligner l'échantillon pour l'imagerie de la région d'intérêt correspondante.

(Facultatif) Répétez les étapes 37 à 47 pour l'imagerie des régions sélectionnées dans l'organe.

Créez une intégration angulaire partielle à partir du balayage de référence toutes les 100 projections pour la correction à champ plat des radiographies de balayage d'échantillons.

Appliquez la correction de champ plat sur toutes les 100 projections de l'échantillon de numérisation avec le champ plat correspondant calculé à l'étape 50.

Reconstruisez le volume 3D à l'aide d'un algorithme de rétroprojection filtré couplé à une récupération de phase à distance unique66 et à un masque flou 2D (la reconstruction peut être effectuée à l'aide d'un code de reconstruction tomographique open source, tel que PyHST2 (réf. 67) ou TomoPy68).

(Facultatif) Corrigez les artefacts d'anneaux sur les tranches reconstruites à l'aide de l'algorithme Lyckegaard et al.69 mis à jour (code disponible sur le GitHub indiqué dans la section Disponibilité du code).

Timing variable selon la technique d'imagerie

Imagez l'échantillon monté avec µCT19, clinique CT70,71 ou MRI63. L'échantillon peut être imagé avec autant de ces techniques d'imagerie que souhaité.

(Facultatif) Effectuer une analyse histologique sur l'échantillon biologique. Nous avons utilisé des techniques histologiques standard, bien documentées dans Ross et Pawlina72.

Des conseils de dépannage peuvent être trouvés dans le tableau 1.

Étape 1, prélèvement d'organes : ~3 jours

Étape 2, fixation de l'organe : 4 j

Étapes 3–4A ou 3–4B, préparation de l'orgue avant montage : 16–27 j

Étapes 5 à 16, préparation du gel de montage pour organe : 12 h à 2 j

Étapes 17 à 32, montage et dégazage de l'orgue : ~3 h

Étapes 33 à 53, imagerie sCT : le moment dépend de la technique d'imagerie et de la configuration

Étapes 54–55, imagerie et histologie : le moment dépend de la technique d'imagerie et de la configuration

Ce protocole fournit une méthode pour préparer et stabiliser de grands organes ou des échantillons biologiques pour l'imagerie à haute résolution à l'aide de sCT, µCT, CT clinique ou IRM. Des images typiques d'organes humains sont présentées sur les Fig. 2 et 5. Cette procédure de préparation d'échantillon fournit des images à contraste élevé (selon la modalité d'imagerie), empêche le mouvement de l'échantillon pendant la numérisation, est compatible avec plusieurs modalités d'imagerie et préserve les caractéristiques morphologiques du tissu par rapport à d'autres méthodes de préparation d'échantillon telles que l'inclusion de paraffine. L'échantillon peut être stocké pendant au moins 1 an sans mouvement ni détérioration. Cette méthode permet l'étude 3D de grandes structures biologiques telles que les organes humains sans les endommager. Ces images à haute résolution peuvent fournir des informations qualitatives et quantitatives sur les caractéristiques saines ou pathologiques d'un organe, par exemple l'effet du COVID-19 dans les poumons humains36.

Les données d'image utilisées pour créer les figures présentes dans ce document de protocole sont accessibles au public à partir du référentiel de données ESRF (https://human-organ-atlas.esrf.eu) ou auprès des auteurs correspondants.

Les données sCT ont été reconstruites à l'aide d'un code personnalisé écrit dans MATLAB 2017 disponible sur GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon) et le progiciel PyHST2 (https://software.pan-data.eu/software/74/pyhst2). VGSTUDIO MAX 3.5 (Volume Graphics) a été utilisé pour le rendu en volume.

Alho, EJL et al. Coupes histologiques de grande épaisseur comme alternative pour étudier la neuroanatomie sous-corticale humaine microscopique en trois dimensions. Structure du cerveau. Fonct. 223, 1121-1132 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Kofler, L. et al. Histologie tridimensionnelle par rapport à l'histologie de coupes en série dans le traitement du carcinome basocellulaire primaire : une étude randomisée, prospective et en aveugle de 569 tumeurs. J.Eur. Acad. Dermatol. Vénéréol. 35, 1323-1330 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pichat, J., Iglesias, JE, Yousry, T., Ourselin, S. & Modat, M. Une étude des méthodes de reconstruction histologique 3D. Méd. Image anale. 46, 73-105 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Eberle, AL & Zeidler, D. Microscopie électronique à balayage multifaisceaux pour l'imagerie à haut débit dans la recherche en connectomique. Devant. Neuroanat. 12, 112 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hildebrand, DGC et al. Microscopie électronique en coupe série du cerveau entier chez le poisson zèbre larvaire. Nature 545, 345–349 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W. & Ramos, I. Reconstruction tridimensionnelle par microscopie électronique dans les sciences de la vie : une introduction pour les biologistes des cellules et des tissus. Mol. Repr. Dév. 82, 530–547 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tainaka, K. et al. Imagerie du corps entier avec résolution unicellulaire par décoloration des tissus. Cellule 159, 911–924 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhao, S. et al. Sondage cellulaire et moléculaire d'organes humains intacts. Cellule 180, 796–812.e19 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai, R. et al. L'imagerie panoptique de souris transparentes révèle des projections neuronales du corps entier et des connexions crâne-méninges. Nat. Neurosci. 22, 317-327 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pailhé, R. et al. Évaluation qualitative et quantitative de la dégénérescence du cartilage à l'aide de la tomographie par cohérence optique plein champ ex vivo. Ostéoarthr. Cartil. 26, 285-292 (2018).

Article Google Scholar

Raghunathan, R., Singh, M., Dickinson, ME et Larin, KV Tomographie par cohérence optique pour l'imagerie embryonnaire : une revue. J. Biomed. Opter. 21, 1 (2016).

Article Google Scholar

Lefort, C. Une revue de la microscopie multiphotonique biomédicale et de ses sources laser. J.Phys. Appl. Phys. 50, 423001 (2017).

Article Google Scholar

Disney, CM, Lee, PD, Hoyland, JA, Sherratt, MJ & Bay, BK Un examen des techniques de visualisation de la déformation de la microstructure des tissus mous et de quantification de la souche ex vivo : déformation de la microstructure des tissus mous et quantification de la souche. J. Microsc. 272, 165-179 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Schueder, F. et al. Imagerie super-résolution 3D multiplexée de cellules entières par microscopie confocale à disque tournant et DNA-PAINT. Nat. Commun. 8, 2090 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Goth, W., Lesicko, J., Sacks, MS & Tunnell, JW Analyse optique des structures des tissus mous. Annu. Rév. Biomed. Ing. 18, 357–385 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edlow, BL et al. IRM 7 Tesla du cerveau humain ex vivo à une résolution de 100 microns. Sci. Données 6, 244 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bouazizi, K. et al. Différenciation et quantification de la fibrose, de la graisse et de la fibrose graisseuse dans le myocarde auriculaire gauche humain à l'aide d'IRM ex vivo. PLoS ONE 13, e0205104 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Verleden, SE et al. Perte de petites voies respiratoires dans le poumon physiologiquement vieillissant : une étude transversale dans les poumons de donneurs inutilisés. Lancet Respir. Méd. 9, 167-174 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Withers, PJ et al. Tomodensitométrie à rayons X. Nat. Rev. Methods Primers 1, 18 (2021).

Mastrogiacomo, M., Campi, G., Canceledda, R. & Cedola, A. Les techniques de rayonnement synchrotron stimulent la recherche en ingénierie des tissus osseux. Acta Biomater. 89, 33–46 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Longo, E. et al. Distribution spatiale 3D des nanoparticules dans les métastases cérébrales de souris par tomographie à contraste de phase aux rayons X. Devant. Oncol. 11, 554668 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hwu , Y. , Daisy , G. & Chiang , A.-S. Q&R : pourquoi utiliser la tomographie à rayons X synchrotron pour la cartographie multi-échelle du connectome ? BMC Biol. 15, 122 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Yokawa, K. et al. Imagerie en contraste de phase des rayons X basée sur le rayonnement synchrotron des parois aortiques dans la dissection aortique aiguë. JVS Vasc. Sci. 1, 81-91 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y., Nelson, J., Holzner, C., Andrews, JC et Pianetta, P. Progrès récents dans l'imagerie par contraste de phase à rayons X durs basée sur le synchrotron. J.Phys. Appl. Phys. 46, 494001 (2013).

Article Google Scholar

Gonzalez-Tendero, A. et al. Anatomie détaillée et quantitative du cœur entier, structure des myofibres et système vasculaire à partir de la tomographie micro-calculée basée sur le rayonnement synchrotron à contraste de phase des rayons X. EUR. Coeur J. Cardiovasc. Imagerie 18, 732–741 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Planinc, I. et al. Évaluation complète du remodelage du myocarde dans les cardiopathies ischémiques par imagerie par contraste de phase aux rayons X basée sur la propagation synchrotron. Sci. Rép. 11, 14020 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chin, A.-L. et coll. Une stratégie d'imagerie par rayons X synchrotron pour cartographier les cerveaux des grands animaux. Menton. J.Phys. 65, 24–32 (2020).

Article CAS Google Scholar

Endrizzi, M. Imagerie à contraste de phase aux rayons X. Nucl. Instrument. Méthodes Phys. Rés. Secte. Accél. Les spectromètres détectent. Assoc. Équiper. 878, 88–98 (2018).

Article CAS Google Scholar

Schulz, G. et al. Imagerie tomographique à haute résolution d'un cervelet humain : comparaison de l'absorption et du contraste de phase basé sur un réseau. JR Soc. Interface 7, 1665-1676 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Shinohara, G. et al. Visualisation tridimensionnelle du tissu de conduction cardiaque humain dans des échantillons de cœur entier par imagerie CT à contraste de phase haute résolution utilisant un rayonnement synchrotron. Monde J. Pediatr. Congénitale. Chirurgie cardiaque. 7, 700–705 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Westöö, C. et al. Types distincts de lésions plexiformes identifiées par micro-CT à contraste de phase synchrotron. Suis. J. Physiol. Cellule pulmonaire. Mol. Physiol. 321, L17–L28 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Borisova, E. et al. Reconstruction volumique complète par tomographie à rayons X à résolution micrométrique d'un poumon de rat juvénile post-mortem intact. Histochem. Cell Biol. 155, 215-226 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Broche, L. et al. Fermeture individuelle des voies respiratoires caractérisée in vivo par imagerie CT à contraste de phase dans un poumon de lapin blessé. Crit. Soin Méd. 47, e774–e781 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dutel, H. et al. Développement neurocrânien du cœlacanthe et évolution de la tête des sarcoptérygiens. Nature 569, 556–559 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mansuit, R. et al. Développement et croissance de la ceinture pectorale et du squelette de la nageoire dans le cœlacanthe existant Latimeria chalumnae. J.Anat. 236, 493–509 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Walsh, CL et al. Imagerie d'organes humains intacts avec résolution locale des structures cellulaires à l'aide de la tomographie à contraste de phase hiérarchique. Nat. Méthodes https://doi.org/10.1038/s41592-021-01317-x (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Dias, CSB, Neto, DPA, Baraldi, GL & Fonseca, MC Analyse comparative des protocoles de préparation d'échantillons de tissus biologiques mous pour des études morphométriques utilisant la microtomographie à rayons X synchrotron. J. Radiat synchrotron. 26, 2013-2023 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, T., Schreibmann, E., Yang, Y. & Xing, L. Correction de mouvement pour une meilleure localisation de la cible avec tomographie à faisceau conique embarquée. Phys. Méd. Biol. 51, 253-267 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sun, T., Kim, J.-H., Fulton, R. & Nuyts, J. Un schéma itératif d'estimation et de compensation de mouvement basé sur la projection pour la tomodensitométrie de la tête. Méd. Phys. 43, 5705–5716 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Topal, E. et al. Tomographie à rayons X multi-échelles et algorithmes d'apprentissage automatique pour étudier les électrocatalyseurs de MoNi4 ancrés sur des cuboïdes de MoO2 alignés sur de la mousse de Ni. BMC Mater. 2, 5 (2020).

Article Google Scholar

Topal, E., Löffler, M. & Zschech, E. Compensation d'inexactitude basée sur l'apprentissage profond dans la reconstruction de données XCT haute résolution. Sci. Rep. 10, 7682 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burger, M. et al. Une méthode de reconstruction variationnelle pour la tomographie dynamique à rayons X sous-échantillonnée basée sur des modèles de mouvement physique. Problème inverse. 33, 124008 (2017).

Article Google Scholar

Patzelt, M. et al. Méthode de fixation à l'éthanol pour l'imagerie cardiaque et pulmonaire en micro-CT. Jpn. J. Radiol. 37, 500–510 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ackermann, M. et al. La circulation bronchique dans la pneumonie COVID-19. Suis. J. Respir. Crit. Soin Méd. 205, 121–125 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ackermann, M. et al. La trajectoire mortelle du COVID-19 pulmonaire est entraînée par l'ischémie lobulaire et le remodelage fibrotique. eBioMedicine 85, 104296 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodgers, G. et al. Impact de la fixation et de l'inclusion de paraffine sur la morphologie du cerveau de la souris : une étude de tomographie basée sur le rayonnement synchrotron. Dans Proc. SPIE Developments in X-Ray Tomography XIII (eds Müller, B. & Wang, G.) 27 (SPIE, 2021) ; https://doi.org/10.1117/12.2595144

Rodgers, G. et al. Histologie virtuelle d'un cerveau entier de souris, de la fixation au formol à l'inclusion de paraffine. Partie 1 : acquisition de données, segmentation des caractéristiques anatomiques, suivi des changements globaux de volume et de densité. J. Neurosci. Méthodes 364, 109354 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Gusnard, D. & Kirschner, RH Rétrécissement des cellules et des organites lors de la préparation à la microscopie électronique à balayage : effets de la fixation, de la déshydratation et du séchage au point critique. J. Microsc. 110, 51–57 (1977).

Article CAS PubMed Google Scholar

Metscher, BD MicroCT pour la biologie du développement : un outil polyvalent pour l'imagerie 3D à contraste élevé à des résolutions histologiques. Dév. Dyn. 238, 632–640 (2009).

Article PubMed Google Scholar

Shirai, R. et al. Contraste d'image rénale amélioré par fixation à l'éthanol en tomodensitométrie à rayons X à contraste de phase. J. Radiat synchrotron. 21, 795–800 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wilke, H.-J., Krischak, S. & Claes, LE La fixation du formol influence fortement les propriétés biomécaniques de la colonne vertébrale. J. Biomech. 29, 1629-1631 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rouleau, L., Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R. & Leask, RL Les variations régionales des propriétés mécaniques du tissu aortique descendant canin changent avec la fixation au formol. Cardiovasculaire. Pathol. 21, 390–397 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Vesper, EO, Hammond, MA, Allen, MR & Wallace, JM Même avec la réhydratation, la conservation dans l'éthanol influence les propriétés mécaniques de l'os et la façon dont l'os réagit à la manipulation expérimentale. Bone 97, 49–53 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Madi, K. et al. Caractérisation in situ des souches à l'échelle nanométrique dans des articulations entières chargées par tomographie à rayons X synchrotron. Nat. Biomédical. Ing. 4, 343–354 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Gignac, PM et al. Tomodensitométrie de contraste à base d'iode diffusible (diceCT): un outil émergent pour l'imagerie 3D rapide et à haute résolution des tissus mous métazoaires. J.Anat. 228, 889–909 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koç, MM, Aslan, N., Kao, AP & Barber, AH Évaluation des agents de contraste de tomographie à rayons X : examen de la production, des protocoles et des applications biologiques. Microsc. Rés. Technologie. 82, 812–848 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Metscher, BD MicroCT pour la morphologie comparative : des méthodes de coloration simples permettent une imagerie 3D à contraste élevé de divers tissus animaux non minéralisés. BMC Physiol. 9, 11 (2009).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mittone, A. et al. Imagerie microCT à faisceau rose multi-échelles sur la ligne de lumière biomédicale ESRF-ID17. J. Radiat synchrotron. 27, 1347–1357 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Xian, RP et al. Un ensemble de données de tomographie à contraste de phase à rayons X multi-échelles d'un poumon gauche humain entier. Sci. Données 9, 264 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saccomano, M. et al. Le µCT à contraste de phase en ligne synchrotron permet une histologie virtuelle détaillée d'échantillons de tissus mous intégrés avec et sans coloration. J. Radiat synchrotron. 25, 1153-1161 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Strotton, MC et al. Optimisation de la microtomographie complémentaire aux rayons X synchrotron des tissus mous pour les échantillons de système nerveux central à coloration réversible. Sci. 8, 12017 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wereszczyńska, B. Échantillons fixés à l'alcool pour IRM post-mortem à contraste élevé. Imagerie médico-légale 25, 200449 (2021).

Article Google Scholar

Roebroeck, A., Miller, KL et Aggarwal, M. IRM de diffusion ex vivo du cerveau humain : défis techniques et avancées récentes. RMN Biomed. 32, e3941 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Shepherd, TM, Thelwall, PE, Stanisz, GJ & Blackband, SJ Les solutions fixatrices d'aldéhyde modifient les propriétés de relaxation et de diffusion de l'eau du tissu nerveux : la fixation de l'aldéhyde modifie les propriétés de l'IRM tissulaire. Magn. Réson. Méd. 62, 26–34 (2009).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilke, J. et al. Appréciation de la qualité méthodologique des études cadavériques : validation de l'échelle QUACS. J.Anat. 226, 440–446 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paganin, D., Mayo, SC, Gureyev, TE, Miller, PR & Wilkins, SW Extraction simultanée de phase et d'amplitude à partir d'une seule image défocalisée d'un objet homogène. J. Microsc. 206, 33-40 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mirone, A., Brun, E., Gouillart, E., Tafforeau, P. & Kieffer, J. Le code distribué hybride PyHST2 pour la reconstruction tomographique à grande vitesse avec reconstruction itérative et capacités de connaissance a priori. Nucl. Instrument. Méthodes Phys. Rés. Secte. B Beam Interaction. Mater. 324, 41–48 (2014).

Article CAS Google Scholar

Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X. & Jacobsen, C. TomoPy : un cadre pour l'analyse des données de tomographie synchrotron. J. Radiat synchrotron. 21, 1188-1193 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lyckegaard , A. , Johnson , G. & Tafforeau , P. Correction des artefacts annulaires dans les images tomographiques à rayons X . Int J. Volume Stat. 18, 1–9 (2011).

Google Scholar

Oishi, H. et al. Les résultats de la TDM pulmonaire ex vivo peuvent prédire l'issue de la phase précoce après la transplantation pulmonaire. PLoS One 15, e0233804 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Verleden, SE et al. Analyse radiologique des poumons de donneurs inutilisés : un outil pour améliorer l'acceptation des donneurs à la transplantation ? Suis. J. Transplantation. 17, 1912-1921 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ross, MH & Pawlina, W. Histologie : un texte et un atlas : avec la biologie cellulaire et moléculaire corrélée (Wolters Kluwer, 2020).

Télécharger les références

Nous remercions S. Bayat (INSERM) pour l'aide lors de la phase de test, P. Masson (LADAF) pour les dissections des corps des donneurs, H. Reichert (ESRF) et R. Tori pour le soutien général du projet et E. Boller, C. Muzelle, R. Homs, C. Jarnias, F. Cianciosi, P. Vieux, P. Cook, L. Capasso et A. Mirone pour leur aide dans les développements et améliorations de l'installation. Nous remercions également R. Engelhardt, A. Muller Brechlin, C. Petzold, N. Kroenke et M. Kuhel pour leur aide dans l'histologie et les autopsies. Ce projet a été rendu possible en partie grâce à la subvention numéro 2020-225394 de la Chan Zuckerberg Initiative DAF, un fonds conseillé de la Silicon Valley Community Foundation et la subvention numéro CZIF2021-006424 de la Chan Zuckerberg Initiative Foundation, les propositions de financement ESRF md1252 et md1290, la Royal Academy of Engineering (CiET1819/10). PDL et CLW remercient chaleureusement le financement de la MRC (MR/R025673/1). MA reconnaît les subventions des National Institutes of Health (HL94567 et HL134229). Ce travail a été soutenu par le registre allemand des autopsies COVID-19 (DeRegCOVID, www.DeRegCOVID.ukaachen.de ; soutenu par le ministère fédéral de la Santé : ZMVI1-2520COR201) et le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche dans le cadre du réseau de médecine universitaire (DEFEAT PANDEMIcs, 01KX2021).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : J. Brunet, CL Walsh.

Département de génie mécanique, University College London, Londres, Royaume-Uni

J. Brunet, CL Walsh, S. Marussi et Peter D. Lee

Installation européenne de rayonnement synchrotron, Grenoble, France

J. Brunet & Paul Tafforeau

Département de radiologie diagnostique et interventionnelle, Hôpital universitaire de Heidelberg, Heidelberg, Allemagne

WL Wagner

Centre de recherche pulmonaire translationnelle Heidelberg (TLRC), Centre allemand de recherche pulmonaire (DZL), Heidelberg, Allemagne

WL Wagner

Laboratoire d’Anatomie des Alpes Françaises (LADAF), Université Grenoble Alpes, Grenoble, France

A. Bellier

Institut de pathologie, École de médecine de Hanovre, Hanovre, Allemagne

C. Werlein & DD Jonigk

Recherche biomédicale sur les maladies pulmonaires en phase terminale et obstructives à Hanovre (BREATH), Centre allemand de recherche pulmonaire (DZL), Hanovre, Allemagne

DD Jonigk

Centre de formation chirurgicale, d'anatomie et de recherche d'Anvers (ASTARC), Université d'Anvers, Anvers, Belgique

Passé SE

Institut de pathologie et de pathologie moléculaire, Helios University Clinic Wuppertal, Université de Witten/Herdecke, Wuppertal, Allemagne

M.Ackermann

Institut d'anatomie fonctionnelle et clinique, Centre médical universitaire de l'Université Johannes Gutenberg de Mayence, Mayence, Allemagne

M.Ackermann

Complexe de recherche à Harwell, Didcot, Royaume-Uni

Peter D. Lee

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

PT, PDL, DDJ, MA, CLW et WLW ont conceptualisé le projet et conçu des expériences. MA, CW, PT, AB, SEV, CLW et JB ont effectué et contribué aux autopsies et à la préparation des échantillons. PT a conçu et construit l'instrumentation et réalisé l'imagerie HiP-CT. Porte-échantillons conçus par SM. PT a conçu et mis en œuvre des méthodes de reconstruction tomographique. JB, PT, CLW et PDL ont rédigé l'article. Tous les auteurs ont participé à la révision et à la révision du manuscrit.

Correspondance à J. Brunet, CL Walsh, Peter D. Lee ou Paul Tafforeau.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Protocols remercie Ali Erturk, Stuart Stock et Hiroki Ueda pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Références clés utilisant ce protocole

Walsh, CL et al. Nat. Méthodes 18, 1532-1541 (2021) : https://doi.org/10.1038/s41592-021-01317-x

Ackermann, M. et al. J'ai. J. Respirez. Crit. Quelle méd. 205, 121-125 (2022) : https://doi.org/10.1164/rccm.202103-0594IM

Ackermann, M. et al. eBioMedicine 85, 104296 (2022) : https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104296

Ce protocole a été développé de manière itérative en surmontant tous les différents défis liés à l'imagerie des tissus mous, au dépôt de dose et à la tomographie locale.

Les données sur le cœur, les reins et le cerveau sont présentes dans l'Atlas d'organes humains (https://human-organ-atlas.esrf.eu). Les données sur le foie ne sont pas incluses dans l'Atlas d'organes humains en raison du grand nombre d'artefacts présents dans les images en raison de la formation de bulles lors de la numérisation. Cependant, les images sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. La formation de ces bulles s'est produite parce qu'un crash du logiciel de la ligne de lumière a fait que le faisceau est resté dans la même position pendant plusieurs heures, dépassant le seuil de dose de l'organe. D'autres foies ont été scannés sans artefacts.

Le processus décrit dans ce document de protocole devrait fonctionner pour tous les organes principaux, mais seuls les organes énumérés ici ont été testés. Les durées maximales de dégazage indiquées ici sont spécifiques à notre configuration de dégazage sous vide et sont susceptibles de changer en fonction de la pompe, du volume à pomper, de la section de pompage, de la quantité de gaz à évacuer et des chemins que le gaz peut emprunter pour quitter l'échantillon. En tant que tels, ils doivent être adaptés à chaque configuration de vide utilisateur en regardant l'intensité de bouillonnement comme expliqué à l'étape 4A (ii) du protocole.

Le récipient étanche de gauche est un récipient Medline Scientific (n° de cat. 129-0592) de 3 L. Le récipient étanche de droite est un récipient Lock & Lock (n° de cat. INL-403) de 2,1 L. Les deux sont à l'intérieur d'un support de récipient sur mesure décrit dans Données étendues Fig. 5.

Deux contenants sont représentés à l'intérieur du porte-conteneurs sur mesure. Le récipient inférieur contient l'échantillon tandis que le récipient supérieur, appelé récipient de référence, est utilisé pour la correction flat-field.

Les paramètres de balayage optimaux dépendent fortement de l'échantillon et de la configuration et de l'équipement de la ligne de lumière. Les paramètres présentés ici sont donnés à titre d'exemple. Quart d'acquisition signifie un balayage en demi-acquisition plus un balayage annulaire pour augmenter le champ de vision latéral. Mo = molybdène.

Exemple d'échantillon monté avec de la gélose insuffisamment compactée, permettant une rotation sur un léger mouvement.

Springer Nature ou son concédant (par exemple une société ou un autre partenaire) détient les droits exclusifs sur cet article en vertu d'un accord de publication avec le ou les auteurs ou autre(s) titulaire(s) des droits ; l'auto-archivage par l'auteur de la version manuscrite acceptée de cet article est uniquement régi par les termes de cet accord de publication et la loi applicable.

Réimpressions et autorisations

Brunet, J., Walsh, CL, Wagner, WL et al. Préparation de grands échantillons biologiques pour la tomographie à contraste de phase synchrotron haute résolution et hiérarchique avec compatibilité d'imagerie multimodale. Protocole Nat 18, 1441-1461 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

Télécharger la citation

Reçu : 21 juin 2022

Accepté : 12 décembre 2022

Publié: 01 mars 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.